1.实验设计考虑
生物体中总RNA=（～90%）rRNA+ （1～2%）mRNA+（8～9%）其他RNA
2.建库过程
1）总RNA提取
提取后的总RNA要进行纯度(purity)、浓度(quantity)、完整性(RIN)的质量检查。
不同样品的total RNA中mRNA含量差异较大，若total RNA起始投入量过低，不能保证有足够的mRNA用于后续建库，因此建议RNA起始量为1～4μg。
不同RIN（RNA intergrity number）示意图：（从1～10为bad to good）
2）mRNA分离与片段化
3）cDNA第一链合成
随机六聚体引物（random hexamer primer），逆转录酶以mRNA为模版合成cDNA
4）cDNA第二链合成
5）双链cDNA的末端修复
末端补齐，再纯化修复后的cDNA。ds cDNA3‘端加A（dA – tailing）。
6） 连接接头
然后纯化连接了接头的 ds cDNA
7）PCR富集文库
扩增完纯化后，进行文库质检，质检完的文库就可以拿去上机测序了。
The End
怀念那些无所事事一整个夏天的年少
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