在线通路注释，一般使用DAVID、KASS、KOBAS等工具。
Kobas : KOBAS（基于KEGG Orthology Based Annotation System）是用于基因/蛋白质功能注释（注释模块）和功能集富集（Enrichment module）的Web服务器。给定一组基因或蛋白质，它可以确定通路，疾病和基因本体论（GO）术语是否显示统计学显着性。
KOBAS 3.0由两个功能组成，注释（Annotation）和富集（Enrichment）
KOBAS 3.0的输入不支持gene symbol，一般操作将Symbol ID转换成Entrez Gene ID（或者）ensembl格式的ID。
推荐进行基因ID转换的网站：gprofiler ： http://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gconvert.cgi
注释（Annotation）：
对于Annotation模块，它接受基因/蛋白质列表作为输入，包括ID或序列。 对于每个基因，您可以找到与该基因相关的途径，疾病和基因本体(GO).
富集（Enrichment）
富集模块为您提供答案,了解哪些途径,疾病和GO术语与您刚输入的基因/蛋白质具有统计学意义。
该模块在KOBAS 2.0中称为“识别”。它接受与Annotation模块相同的输入格式，并且还允许Annotation模块的结果作为输入（请参阅3.1中的详细信息）。它基于第一代基因集富集方法，一种称为过表达分析（ORA）的基因水平统计，这是一种基于超几何分布的简单且经常使用的测试。
注意事项：
输入数据：
1、Gene/protein ID、Sequences（FASTA format）、Tabular BLAST output
2、Gene expression matrix
输出结果：
- Term KEGG的注释类
- Database 数据库类型
- ID Term对应的ID
- Input 输入的基因数目
- input number 富集到这个Term的输入基因个数
- Background number 数据库中富集到这个通路的总有基因数量
- P-value P值
- Corrected P-Value 校正后P值
KOBAS 本地操作：
下载 应用： http://kobas.cbi.pku.edu.cn/kobas-2.1.1/kobas-3.0.3.tar.gz
下载 数据库： http://kobas.cbi.pku.edu.cn/download_file.php?type=seq_pep&filename=ko.pep.fasta.gz
1、KO数据库建索引 $ diamond makedb --in ko.pep.fasta --db ko -p 24 2、diamond blast $ diamond blastx -e 1e-5 --db ko -q genes.nucleotide.catalog.fa -p 24 -f 6 qseqid qlen qstart qend qcovhsp slen sstart send score evalue positive length ppos sseqid stitle nident mismatch gaps gapopen bitscore pident -o kobas.annotation 转成Tabular BLAST output format $ awk -F "\t" '{print $1"\t"$14"\t"$21"\t"$12"\t"$17"\t"$19"\t"$3"\t"$4"\t"$7"\t"$8"\t"$10"\t"$20}' kobas.annotation > kobas.annotation.m8 注释 $ annotate.py -i kobas.annotation.m8 -t blastout:tab -s ko -o kegg.annotate.tmp 检测 $ identify.py -f kegg.annotate.tmp -o kegg.identify.tmp -p K -m h -b tmp 富集 $ cluster.py -i kegg.identify.tmp -m k -o kegg.cluster.txt 查看注释结果 $less kegg.annotate.tmp ko KEGG Orthology Method: BLAST Options: evalue <= 1e-05; rank <= 5 Summary: 3431 succeed, 2654 fail #Query KO ID|KO name|Hyperlink 序列 K号|酶号 基因|ko pathway路径 gene_3301|GeneMark.hmm|1482_nt|+|| K00045|E1.1.1.67, mtlK|http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?ko:K00045 gene_3075|GeneMark.hmm|774_nt|+|| K01692|paaF, echA|http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?ko:K01692 gene_1278|GeneMark.hmm|1332_nt|+|| None ...... Query: gene_3301|GeneMark.hmm|1482_nt|+|| KO: K00045 E1.1.1.67, mtlK Pathway: Fructose and mannose metabolism KEGG PATHWAY ko00051 Query: gene_3075|GeneMark.hmm|774_nt|+|| KO: K01692 paaF, echA Pathway: Fatty acid degradation KEGG PATHWAY ko00071 Tryptophan metabolism KEGG PATHWAY ko00380 ....功能富集分析概述 ： https://www.jianshu.com/p/5a4bda
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